RNA pull down：RNA沉淀检测，是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验方法之一。使用体外转录将RNA进行生物素标记，并与细胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白复合物。复合物通过磁珠结合后分离，复合物纯化洗脱后通过Western blot验证检测特性的蛋白。若筛选可能结合的蛋白通过质谱实验进行检测筛选。

  实验流程：

  2.1生物素探针标记RNA

  1 取出RNA 3' End Desthiobiotinylation试剂盒，将试剂盒中的PEG及DMSO置于常温，其余组分置于冰上融化;

  2 依照RNA母管含量，用DEPC水溶解RNA，将浓度调整至10ug/管，用10μl DEPC水溶解。同时溶解试剂盒中Control RNA作为阴性对照;

  3 取对照RNA及目标RNA各5μl，放于200 μl的PCR管中，每管可加1μl DMSO，混匀后置于PCR仪上，85℃，5min，然后立即置于冰上5min;

  4 按照下表配制探针标记反应的体系：

  5 混匀上述反应体系，之后放至PCR仪内，16℃，4h至过夜。反应时间的延长可提高连接效率;连接反应结束后，向每管加400μl nuclease free-water;

  6 每管加300μl酚氯仿提取标记成功的RNA;涡旋后最大转速离心15min，小心将上层水相移取到新的EP管中;

  7 加10μl 5M NaCl，2μl糖原，以及600μl 预冷的100%乙醇，放于-20℃或-80℃沉淀，可沉淀过夜。

  2 细胞蛋白裂解

  1 细胞培养在15cm培养皿中，当细胞长至80-90%时，弃去培养基，用预冷的PBS洗3次，吸去上清;

  2 每个培养皿中加入200μl cell lysis buffer;

  3 用细胞刮将细胞刮下，转移至EP管，液氮中反复冻融3次;

  4 离心，4℃，3000rpm，离心10min;

  5 将上清转移至新的EP管中，置于冰上;加200U/ml RNase Inhibitor;

  6 取10-20μl左右上清至新管中，作为实验input。

  3 RNA沉淀

  1 将沉淀过夜的RNA取出，4℃，最大转速离心30min，离心后可见管底的白色沉淀为RNA;

  2 小心移取上清，用1ml 70%乙醇洗涤，8000rpm 离心10min,之后吸净管内液体，空气中晾干RNA;

  3 每管加20μl nuclease free-water溶解RNA，之后将RNA放于PCR仪中，95℃，5min使其变性，之后立即置于冰上，备用。

  4 磁珠预处理

  1取50μl磁珠至离心管中，置于磁力架上，吸去上清。加入1ml 20mM的Tris-HCl(pH7.5)，清洗磁珠后置于磁力架上，吸去上清，重复洗一次。

  2 用800μl 1×binding & washing buffer，洗3次，吸去上清;

  5 RNA 与beads结合

  1 向的beads中加入400μl 2×binding & washing buffer;

  2 向上一步中加入50pmo已标记的RNA，再补380μl DEPC水，使其终体积为800μl;

  3 室温慢速旋转20min，使beads与RNA充分结合，室温孵育15-30min;

  4 将上一步的管子置于磁力架上，吸去上清;

  5 用800μl 1X binding & washing buffer(含RNase Inhibitor, 1U/ μl)，洗3次，去除上清;

  6 用cell lysis buffer A洗一次beads，吸去上清，注意不要让beads干掉。

  6 RNA与蛋白相互作用检测

  1 向上一步已处理好的beads中每管加入500μl 细胞裂解液;同时每管加入1U/ μl浓度的RNase Inhibitor;

  2 4℃慢速旋转2h，使beads与细胞裂解液充分结合;

  3 置于磁力架上吸去上清，用400 μl新鲜配制的cell lysis buffer A(+RNase Inhibitor+蛋白酶抑制剂)，洗5次beads;

  4 吸去上清，加入50ul的Elution buffer，轻轻将磁珠吹匀，置于37℃孵育30min，置于磁力架上，收集上清，做Western blot检测或者质谱检测。

  7 质谱

  将每个样品中富集的蛋白质(100 ug)加到30kDa MWCO旋转过滤器上并离心。 通过将样品与100μL 30mM IAA和8M尿素的100μL15mM DTT在8 M尿素中在黑暗中孵育，并分别孵育45分钟，来进行蛋白质还原和烷基化。 然后将样品分别用100μL 8M尿素和100μL 50mM TEAB洗涤两次。以1:50的酶与蛋白质比例添加200μL 50mM TEAB中的胰蛋白酶。在37°C消化16小时后，通过离心将胰蛋白酶肽收集在新试管中。再次进行200μL 50mM TEAB洗涤。FASP方案中的所有离心步骤均以14,000xg进行15分钟。

  胰蛋白酶肽在Speed Vac中干燥。然后将肽重悬于20μLiTRAQ溶出缓冲液(0.5M TEAB)中，并根据制造商的8-plex iTRAQ方案进行标记。如表3所示，使用了两个独立的8重iTRAQ组以容纳所有16个样品，如表3所示。在与iTRAQ试剂温育2小时后，将所有样品用碳酸氢铵淬灭，并在每次运行中合并，并通过Speed Vac浓缩至约30μL。在XBridge RP色谱柱(5μm，150Å，4.6mm X250 mm)上进行肽分离。流动相A含2%乙腈(ACN)，流动相B含98%ACN。使用NH4OH将两者的pH均调节至10.0。溶剂梯度设定如下：2分钟内2–5%B; 11分钟内5–18%B;9分钟内18–32%B;1分钟内获得32–95%B;保持在95%B下5分钟。胰蛋白酶肽以1mL / min的流速分离，并通过214nm的UV监测。每分钟收集一次洗脱液，并通过串联将其合并为8个馏分。将所有流分干燥并重新溶解在10μL的3%ACN和0.1%甲酸中，然后进行LC-MS / MS分析。

  将肽上样到反相捕获柱上。在反相纳米柱上进行肽分离，线性梯度在90分钟内为3–25%ACN，在10分钟内为25-50%ACN，并在3分钟内达到90%ACN。在Dionex U3000 UPLC系统上以200nl/min的恒定流速在最后5分钟内保持90%的流速，然后在最后2分钟内返回3%ACN，最后保持2分钟。流动相均补充有0.1%FA。通过配备有以2.1 kV操作的纳米级的Q Exactive四极-Orbitrap质谱仪分析洗脱的肽。

  LC-MS / MS数据是通过数据依赖分析(DDA)方案收集的，包括从400到1,200Th的完整MS调查扫描，分辨率为70,000 FWHM(在m / z 200 Th)，并具有自动增益控制(AGC)设置为1e6，然后进行MS2扫描，选择20个最强的峰，以便通过高能碰撞解离(HCD)进行裂解。归一化碰撞能量设置为32%。 所有MS2光谱均以17,500 FWHM分辨率获得，并且AGC设置为2e5。

  使用MS2报告离子8plex iTRAQ定量方案，使用MaxQuant(1.6.1.0版)处理所得原始数据。再与反向诱饵数据库连接的犬UniProt数据库中搜索MS2光谱。胰蛋白酶/ P被指定为裂解酶，最多允许2个缺失的裂解。对于前体离子，质量误差设置为10 ppm，对于碎片离子，质量误差设置为0.02 Da。将Cys上的氨基甲酰甲基化指定为固定修饰，将Met上的氧化和蛋白质N端的乙酰化指定为可变修饰。将蛋白质和肽的FDR水平设置为0.01以过滤结果。每次运行中所有样品中具有超过2个MS2光谱且非零iTRAQ报告离子强度的蛋白质都用于蛋白质定量。

  使用学生t检验(p <0.05)选择差异表达的蛋白质。 DAVID(//david.ncifcrf.gov/)和STRING(//www.string-db.org/)用于基因聚类分析(GO)注释和功能性蛋白质关联网络分析。

  实验结果示例：

图 RNA pulldown质谱检测示例图

  A RNA pulldown蛋白银染示例图。B,C 质谱检测结果GO聚类分析示例图。D,E 质谱检测结果KEGG信号通路分析示例图。F 筛选出蛋白相互作用图