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细胞增殖是生物体的重要生命特征,细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的细胞,用来补充体内衰老或死亡的细胞。中原代细胞和肿瘤细胞株均有增殖能力,为检测研究的药物或者基因的变化对细胞的增殖的影响,一般会使用MTT检测、CCK8检测、BrdU染色、EdU染色等实验。
1
MTT 是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。适合贴壁细胞,不适合悬浮细胞检测。
实验流程:
1.1、使用血球计数板对细胞计数计数,接种3000-5000个细胞至96孔板,轻轻摇晃均匀后放入培养箱培养过夜;
1.2、根据实验目的进行加药或其他处理;
1.3、细胞培养到指定时间点后,加入10μl MTT溶液,轻轻混匀后放入培养箱中培养3h;
1.4、去除培养基,加入DMSO溶液,轻轻摇晃将96孔板放入酶标仪检测。
2
Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,是一种类似于MTT的化合物,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的情况下,被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(formazan)。细胞增殖越多越快,颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅,对于同样的细胞,颜色的深浅与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。悬浮细胞和贴壁细胞均可以进行检测。
实验流程:
2.1、使用血球计数板对细胞计数计数,接种3000-5000个细胞至96孔板,轻轻摇晃均匀后放入培养箱培养过夜;
2.2、根据实验目的进行加药或其他处理;
2.3、细胞培养到指定时间点后,加入10μl CCK8溶液,轻轻混匀后放入培养箱中培养2-4h;
2.4、将96孔板放入酶标仪检测。
3 BrdU染色检测
BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶的衍生物,常用于标记活性中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)。随着DNA复制可以可以进入子细胞中,BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。
EdU和BrdU类似,另一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子,通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性,通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。具体操作和BrdU类似。
实验流程:
3.1、接种5×105个细胞于玻璃底培养皿中,摇晃均匀后放入培养箱培养过夜,根据实验目的加入药物或其他处理。
3.2、制备适量50μM BrdU培养基,37℃,孵育2h。除去培养液,用PBS洗涤3次。
3.3、加入4%多聚甲醛常温固定10min。
3.4、将多聚甲醛去除,加入预冷的PBS洗3次,每次5min。
3.5、加入含0.5% Triton X-100的PBS,在冰上将细胞膜穿刺10min。
3.6、去除PBS-Triton,加入预冷的PBS洗3次,每次5min。
3.7、加入PBS-3%BSA,常温封闭30min。
3.8、将BrdU抗体按照1:100的比例稀释在PBS-1%BSA溶液中,去除封闭液后,加入一抗,室温孵育2h或者4℃孵育过夜。
3.9、去除一抗,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5min。
3.10、将荧光二抗分别按照1:400比例稀释在PBS-1%BSA溶液中,去除PBS-T后,加入二抗,室温避光孵育1h。
3.11、去除二抗,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5min。
3.12、加入100ng/mL DAPI溶液,室温避光孵育10min。
3.13、去除DAPI,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5min。
3.14、加入防荧光淬灭溶液,4℃避光放置或直接在激光共聚焦显微镜拍照。
4 细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验是检测单个细胞增殖能力的实验方法。当一个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,形成克隆,每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.2-1mm之间,集落的大小和数量反应该细胞独立生存能力和增殖能力,从而该实验反应细胞增殖的情况。
实验流程:
4.1、接种500个细胞于六孔板中,轻轻混匀后放入培养箱中培养;
4.2、培养过夜后,根据实验目的加入药物或其他处理;
4.3、每隔3天更换一次培养基,培养2周后,去除培养基,加入PBS洗一次;
4.4、加入4%多聚甲醛或者乙醇固定10min,去除培养基,加入结晶紫染色液,常温染色20min;
4.5、加入PBS洗3次,将六孔板放入烘箱中烘干,对克隆进行计数和拍照。
图 细胞增殖能力实验检测
A MTT和CCK8检测图; B BrdU染色检测图及统计图; C 细胞克隆形成检测图及统计图
细胞增殖是生物体的重要生命特征,细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的细胞,用来补充体内衰老或死亡的细胞。中原代细胞和肿瘤细胞株均有增殖能力,为检测研究的药物或者基因的变化对细胞的增殖的影响,一般会使用MTT检测、CCK8检测、BrdU染色、EdU染色等实验。
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MTT 是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。适合贴壁细胞,不适合悬浮细胞检测。
实验流程:
1.1、使用血球计数板对细胞计数计数,接种3000-5000个细胞至96孔板,轻轻摇晃均匀后放入培养箱培养过夜;
1.2、根据实验目的进行加药或其他处理;
1.3、细胞培养到指定时间点后,加入10μl MTT溶液,轻轻混匀后放入培养箱中培养3h;
1.4、去除培养基,加入DMSO溶液,轻轻摇晃将96孔板放入酶标仪检测。
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Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,是一种类似于MTT的化合物,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的情况下,被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(formazan)。细胞增殖越多越快,颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅,对于同样的细胞,颜色的深浅与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。悬浮细胞和贴壁细胞均可以进行检测。
实验流程:
2.1、使用血球计数板对细胞计数计数,接种3000-5000个细胞至96孔板,轻轻摇晃均匀后放入培养箱培养过夜;
2.2、根据实验目的进行加药或其他处理;
2.3、细胞培养到指定时间点后,加入10μl CCK8溶液,轻轻混匀后放入培养箱中培养2-4h;
2.4、将96孔板放入酶标仪检测。
3 BrdU染色检测
BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶的衍生物,常用于标记活性中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)。随着DNA复制可以可以进入子细胞中,BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。
EdU和BrdU类似,另一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子,通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性,通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。具体操作和BrdU类似。
实验流程:
3.1、接种5×105个细胞于玻璃底培养皿中,摇晃均匀后放入培养箱培养过夜,根据实验目的加入药物或其他处理。
3.2、制备适量50μM BrdU培养基,37℃,孵育2h。除去培养液,用PBS洗涤3次。
3.3、加入4%多聚甲醛常温固定10min。
3.4、将多聚甲醛去除,加入预冷的PBS洗3次,每次5min。
3.5、加入含0.5% Triton X-100的PBS,在冰上将细胞膜穿刺10min。
3.6、去除PBS-Triton,加入预冷的PBS洗3次,每次5min。
3.7、加入PBS-3%BSA,常温封闭30min。
3.8、将BrdU抗体按照1:100的比例稀释在PBS-1%BSA溶液中,去除封闭液后,加入一抗,室温孵育2h或者4℃孵育过夜。
3.9、去除一抗,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5min。
3.10、将荧光二抗分别按照1:400比例稀释在PBS-1%BSA溶液中,去除PBS-T后,加入二抗,室温避光孵育1h。
3.11、去除二抗,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5min。
3.12、加入100ng/mL DAPI溶液,室温避光孵育10min。
3.13、去除DAPI,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5min。
3.14、加入防荧光淬灭溶液,4℃避光放置或直接在激光共聚焦显微镜拍照。
4 细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验是检测单个细胞增殖能力的实验方法。当一个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,形成克隆,每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.2-1mm之间,集落的大小和数量反应该细胞独立生存能力和增殖能力,从而该实验反应细胞增殖的情况。
实验流程:
4.1、接种500个细胞于六孔板中,轻轻混匀后放入培养箱中培养;
4.2、培养过夜后,根据实验目的加入药物或其他处理;
4.3、每隔3天更换一次培养基,培养2周后,去除培养基,加入PBS洗一次;
4.4、加入4%多聚甲醛或者乙醇固定10min,去除培养基,加入结晶紫染色液,常温染色20min;
4.5、加入PBS洗3次,将六孔板放入烘箱中烘干,对克隆进行计数和拍照。
图 细胞增殖能力实验检测
A MTT和CCK8检测图; B BrdU染色检测图及统计图; C 细胞克隆形成检测图及统计图