透射电镜样本制备方法和要求

透射电镜样本制备方法和要求

1. 生物样品负染：滴在铜网上的样品溶液经1-2%的磷钨酸（PTA，pH6.5-7.0）染色5-10s后干燥，在透射电镜中观察。

2. 生物样品超薄切片制备流程：材料样品的超薄切片制备参见步骤2.4和2.5。

 

样品取材要求：

 

（1）新鲜。（材料离体后1-5min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化）

 

（2）体积小。（厚度< 1mm，长度宽度均< 5mm，固定液渗透能力有限，组织太大会导致无法固定充分）

 

（3）机械损伤小。（动作轻巧，器械锋利，避免对阻止的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。）

 

（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷。（降低酶的活性，减少组织自溶）

 

（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。

 

2.1取样&固定：

 

2.1.1取样及戊二醛固定

 

戊二醛（多为2.5%），超纯水配成6-10%的水溶液，使用前加0.2M磷酸钠缓冲液稀释至所需浓度（有细胞壁的样品5%，无细胞壁样品3%，磷酸缓冲液终浓度0.1M，PH7.2），现配现用。可根据样品选择其他缓冲体系。

 

切取一小块组织，置入预冷的戊二醛固定液（3-5%）中，4℃预固定20分钟后，捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上（已滴有预冷的固定液），在固定液中用将组织切成2-5mm长， 2-3mm宽， 1mm厚的细条，移入盛有预冷的戊二醛固定液的2ml离心管中，4℃固定过夜。

 

（1）植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用真空泵抽出组织内部的气体，使材料沉入固定液中。

 

（2）动物样本的取材，可将动物麻醉或急性处死后切取组织。或者采用原位固定、流灌固定后再切取所需组织。

 

（3）细胞培养的样品，轻微并短暂离心，倒净培养液后，加入预冷的固定液，4℃固定10min后，低温6000rpm/min离心5min（离心力不可过大，离心时间不可过长，避免机械挤压，使用1.5ml离心管方便收集细胞），去上清，滴加新鲜固定液并重悬，4℃固定过夜。

 

漂洗

 

2.1.2锇酸固定

 

倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min。

 

       用1%的锇酸溶液固定样品1-2h。小心取出锇酸废液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；

 

2.2.脱水

 

       用梯度浓度（包括30%，50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理20min；最后过度到纯丙酮处理20min。

 

2.3渗透

 

       用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h：用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；纯包埋剂处理样品过夜。

 

2.4包埋和聚合

 

将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。

 

2.5切片和染色

 

包埋块在超薄切片机中切片，获得100nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5-10min，即可在透射电镜中观察。